潘学军教授团队在MYB转录因子调控泡核桃黄酮醇合成方面取得新进展

潘学军教授团队在MYB转录因子调控泡核桃黄酮醇合成方面取得新进展

近日，Scientia Horticulturae在线发表了贵州大学农学院潘学军教授团队题为：Genome-wide characterization, identification, and function analysis of candidate JsMYB genes involved in regulating flavonol biosynthesis in Juglans sigillata Dode

的研究论文。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.scienta.2023.112044

泡核桃起产于中国西南部，富含黄酮醇(芦丁)。黄酮醇具有显著保健功能，包括抗氧化、抗癌、抗二型糖尿病和保护心脑血管等。因此，提高泡核桃黄酮醇含量对人体健康具有重要意义。MYB基因家族成员可以通过调节初级和次生代谢来应对生物和非生物胁迫，以保证植物的正常生长发育。目前MYB转录因子调控黄酮醇的生物合成，引起了广泛的关注。拟南芥R2R3-MYB转录因子AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111被报道可增加黄酮醇含量。它们的同源基因在许多果树中被鉴定出来(苹果、梨、桃、葡萄)。然而，关于泡核桃中调控泡核桃黄酮醇合成相关MYB转录因子的报道较少。本研究从泡核桃基因组中筛选出222个MYB转录因子，并对其进行保守基序分析、基因结构分析、染色体定位分析、共线性分析、顺式作用元件分析和表达模式分析。通过与拟南芥MYB蛋白进行系统发育分析以及与黄酮醇合成通路重要结构基因的相关性分析鉴定出与黄酮醇生物合成相关的候选MYB转录因子，然后在青皮中沉默和在愈伤组织中过表达对候选MYB基因进行功能验证。本研究结果不仅为泡核桃果实黄酮醇合成的调控提供理论依据，而且为利用愈伤组织转化系统和基因沉默技术在坚果中进行基因功能研究提供实践基础。

1. 泡核桃JsMYBs蛋白的系统发育分析

泡核桃中共筛选出222个MYB转录因子。其中JsMYB121、JsMYB141、JsMYB148、JsMYB170与拟南芥AtMYB11、AtMYB12、AtMYB111聚集在同一分支，说明这4个MYB转录因子可能是泡核桃中调控黄酮醇合成的关键转录因子(见图1)。

图1 泡核桃MYB蛋白与拟南芥MYB蛋白的系统发育树

2. 泡核桃黄酮醇通路基因表达和芦丁含量的相关性分析

泡核桃果实青皮中芦丁含量明显高于种仁，青皮中芦丁含量呈逐渐下降的趋。PAL (Isoform0031818, Isoform0033921)、4CL (Isoform0003465)、CHI (Isoform0000144)和FLS (Isoform0016123)在各自的基因家族中FPKM值较高，其变化趋势与青皮和种仁中芦丁含量的变化趋势一致(见图2)。

图2青皮和种仁发育中黄酮醇生物合成通路的模型

PAL(Isoform0031818)、4CL(Isoform0038127)、CHS (Isoform0021293)、CHI(Isoform0000144)、FLS(Isoform0016123) 分别是各自基因家族中与芦丁含量相关性最高的成员，这些基因可能在泡核桃果实黄酮醇的合成中发挥重要作用。它们被选为转录因子功能验证结果的衡量指标。JsMYB141和JsMYB170的FPKM值与黄酮醇合成途径中的大部分重要结构基因的表达水平具有良好的相关性，推测它们调控泡核桃果实黄酮醇的合成(见表1)。

表1 基因表达间及基因表达与芦丁含量间的相关性分析

3. 泡核桃黄酮醇合成候选JsMYBs基因的愈伤组织过表达分析

为了进一步研究JsMYB121、JsMYB141、JsMYB148和JsMYB170在黄酮醇合成中的作用，将其在愈伤组织中进行过表达(见图3)。在过表达JsMYB141的愈伤组织中，JsPAL、JsCHS、JsF3ʼ5ʼH和JsFLS的表达水平增加了约5

，芦丁和杨梅素含量极显著上升。在过表达JsMYB170的愈伤组织中，Js4CL、JsCHS、JsCHI、JsFLS和JsDFR的表达水平增加了7倍以上，芦丁和槲皮素含量极显著上升。过表达JsMYB141和JsMYB170的愈伤组织经DBPA染色后出现强烈的橙黄色荧光。这些结果表明，JsMYB141和JsMYB170能提高黄酮醇含量。

图3泡核桃JsMYB121、JsMYB141、JsMYB148和JsMYB170的愈伤组织过表达

4. 泡核桃候选JsMYBs基因在果实青皮中的沉默分析

为了进一步验证愈伤组织中过表达结果的可靠性，在泡核桃果实青皮进行了VIGS试验(见图4)。在侵染后第8天，JsMYB141和JsMYB170的转录水平分别下降了99.5%和99.4%。在沉默JsMYB141的青皮中，JsPAL、JsC4H、Js4CL、JsCHI、JsF3ʼH、JsF3ʼ5ʼH和JsFLS的表达水平下降了40%以上，芦丁和杨梅素含量显著下降。在沉默JsMYB170的青皮中，JsC4H、JsCHS、JsCHI、JsF3ʼH、JsF3ʼ5ʼH、JsFLS和JsDFR的表达水平下降了70%以上，芦丁和山奈酚含量显著下降。 沉默JsMYB141和JsMYB170的青皮出现褐变表型。综上所述，JsMYB141和JsMYB170是调控泡核桃果实黄酮醇合成的转录因子。

图4泡核桃JsMYB121、JsMYB141、JsMYB148和JsMYB170的青皮沉默

5. 结论

泡核桃基因组中共鉴定出222个MYB基因。JsMYB141和JsMYB170是调控泡核桃果实黄酮醇生物合成的重要转录因子。JsMYB141通过调控JsPAL、JsCHS、JsF3ʼ5ʼH、JsFLS的转录水平来正调控杨梅素、芦丁的含量。JsMYB170通过调控JsCHS、JsCHI和JsFLS的转录水平来正调控山奈酚、槲皮素、芦丁的含量。

贵州大学农学院潘学军教授和张文娥教授为该论文通讯作者，硕士研究生李春香为该论文第一作者，黄东、魏蓉、洪艳阳等人参与了工作。该项目得到国家自然基金(32060673)、贵州省林业科研课题[2022] No. 18的资助。

团队负责人：潘学军，贵州大学农学院院长，教授，博士生导师。国务院特殊津贴专家，省管专家，贵州省高层次创新人才（百层次），贵州省林木第一批“百千万人才”首席专家（经济林），贵州大学学科学术带头人，全国优秀科技特派员巡讲员、贵州省首席科技特派员（核桃栽培），国家自然科学基金委评审专家，教育部学位中心评审专家。主要从事喀斯特高原山地特有果树种质资源的挖掘与开发利用研究。近五年先后主持国家科技支撑计划课题、国家自然科学基金、贵州省科技重大专项分课题、贵州省高层次人才培养计划等省部级课题12项、横向课题16项。作为主要研究人员获贵州省科技成果转化一等奖（排名2）1项，主持获得授权国家发明专利5项、实用新型专利4项；主持培育核桃新品种5个，省级认定3个。发表学术论文35篇，其中SCI/EI/一级学报收录18篇。

张文娥，教授，贵州大学硕士生导师。现任中国园艺学会球根花卉分会理事，中国园艺学会球根花卉分会西南地区专家委员会委员，国家自然科学基金委评审专家。重点开展了泡核桃多酚积累及其重要调控基因的挖掘与功能验证、干旱对芭蕉芋品质性质的影响及其调控机理、美人蕉资源遗传多样性等方面的研究。近五年来，先后主持国家自然科学基金、贵州省自然科学基金等省部级项目3项，参与国家科技支撑计划课题、国家自然科学基金、贵州省科技重大专项分课题、贵州省高层次人才培养计划等省部级课题等科研课题8项，获得国家发明专利、实用新型专利7项，发表学术论文20余篇，其中SCI/EI/一级学报收录8篇。

团队研究方向：喀斯特山区特有果树种质资源的鉴选、利用及无公害栽培。